1. 原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的隱性孔雀石綠隱性結(jié)晶紫和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孔隱性雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物隱性孔雀石綠隱性結(jié)晶紫的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)隱性孔雀石綠隱性結(jié)晶紫的含量。
2. 試劑盒組成
（1） 96孔酶標(biāo)板：1塊。
（2） 標(biāo)準(zhǔn)品液:（1.0ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.4ppb、1.6ppb、6.4ppb、25.6ppb。
（3） 酶標(biāo)記物： 1瓶（12ml）。
（4） 抗體工作液： 1瓶（7ml）。
（5） 底物緩沖液： 1瓶（7ml）。
（6） 底物液： 1瓶（7ml）。
（7） 終止液： 1瓶（7ml）。
（8） 20倍濃縮洗液：（50ml）加蒸餾水稀釋到1000ml。
（9） 提取液A
（10） 提取液B
3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
（1）設(shè)備
…微孔板酶標(biāo)儀(450nm)
…均質(zhì)器
…振蕩器
…離心機(jī)
…各種量程的微量移液器
（2）試劑
…蒸餾水
…環(huán)已烷
4. 注意事項(xiàng)
（1）終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
（2）不要使用已過有效日期的隱性孔雀石綠檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用，以免降低靈敏度。
（3）0標(biāo)準(zhǔn)液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質(zhì)，請勿使用。
（4）顯色劑變藍(lán)，表明已變質(zhì)，請勿使用。
5. 儲存條件
（1） 2-8℃保存，切勿冷凍。
（2） 將不用的酶標(biāo)板放進(jìn)原袋中重新密封。
（3） 酶標(biāo)記物和顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
（1） 魚/蝦樣品的準(zhǔn)備（稀釋倍數(shù)2）
A）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
B）稱取1.0g均質(zhì)好的樣品，放入15mL離心管中,加入0.5mL的提取液A,再加入1.5mL的提取液B，渦旋5-10分鐘；
C）3000rpm離心5分鐘，取上清，
D）取上清50μl進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（2） 水質(zhì)樣品（稀釋倍數(shù)1）
離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時試劑的準(zhǔn)備
（1） 注意事項(xiàng)
a) 使用之前將所有試劑平衡至室溫。
b) 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
c) 在使用中不要讓微孔干燥。
d) EIA分析的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點(diǎn)。
e) 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
（2）濃縮洗滌液使用前應(yīng)根據(jù)所需量進(jìn)行20倍稀釋，即按1ml濃縮洗滌液加入19ml蒸餾水的比例進(jìn)行稀釋。
8. 測定程序
（1） 將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所需微量反應(yīng)板（均需2個平行試驗(yàn)）放在反應(yīng)架上。
（2） 加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
（3） 加入50μl已稀釋的抗體應(yīng)用液加入微量反應(yīng)板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)30分鐘。
（4） 棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
（5） 加入100μl酶標(biāo)記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應(yīng)20分鐘。
（6） 棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
（7） 加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。
（8） 加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
10. 結(jié)果
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中隱性孔雀石綠實(shí)際濃度。
11. 測定技術(shù)指標(biāo)
（1） 靈敏度：
隱性孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.1ng/g（0.1ppb）。
（2） 準(zhǔn)確度（回收率）：
回收率為90%±15%。
12. 交叉反應(yīng)活性
隱性孔雀石綠檢測試劑盒能檢測隱性孔雀石綠及其相似物，它們的結(jié)合程度不同。以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率（%CR），所有濃度均為ppb級。
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種類 |
% CR |
|
隱性孔雀石綠 |
100% |
|
孔雀石綠 |
〈10% |
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隱性 |
100% |
|
結(jié)晶紫 |
〈10% |
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